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【THUNDER小课堂】高对比度快速成像
对小鼠肺组织进行高对比度快速成像，可以对肺血管系统的内皮网络和支持细胞进行可视化研究。
本文介绍了在小鼠肺标本中如何利用THUNDER Imager 3D Cell Culture荧光显微镜和即时光学解析（ICC）技术有效地研究控制肺血管形成和维持的细胞和分子机制，以及当肺血管疾病发生时出现的相应问题。肺血管系统是由内皮细胞组成的分支管状网络，这些内皮细胞排列在血管上，和支持细胞构成了血管壁。
从健康角度来看，识别在肺动脉、静脉和毛细血管发育过程中形成肺血管的细胞群类型是很有趣的，有助于它们的维持和修复，以及研究这些细胞的行为和调控信号。
小鼠肺组织图像：（左）原始宽场图像和（右）使用Instant Computational Clearing（ICC）技术后的THUNDER高清图像。图片来源：美国加利福尼亚州Ross Metzger博士。
简 介
肺血管疾病的研究涉及多种方法来探索影响疾病的细胞和分子程序[1，2]。肺血管从胚胎期开始发育，并在出生后继续。肺的支管网络由内皮细胞和支持细胞组成。为了更好地了解血管疾病，科学家研究了形成肺血管的细胞，以及那些有助于血管修复的细胞[1，2]。
由于管状结构，以及肺标本很容易有数百微米厚，因此可视化内皮细胞和支持细胞网络的发育以及血管系统的维持jiju挑战。此处的报告结果展示了如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture显微镜，在小鼠肺组织中有效研究肺血管疾病的机制[3，4]。
挑 战
在肺组织成像时想要获得真实结果，拥有一种可以快速获取高对比度三维图像的解决方案非常关键，确保其中的重要细节得到清晰呈现。传统的宽场显微镜能够对这些厚标本的大面积成像，这种显微镜速度快，检测灵敏度高，但由于非焦信号的干扰，图像模糊，对比度显著降低[3，4]。
方 法
使用THUNDER Imager 3D Cell Culture显微镜对小鼠肺部标本进行成像。使用FITC、Cy3以及Alexa 633对标本进行免疫染色。为了可视化整个肺组织标本，使用20x Plan Fluo Apo 0.4 NA（数值孔径）物镜以及三个荧光通道。为覆盖280µm厚度的样品，采集的图像显示为由115层光学切片组成的扩展景深（EDoF）投影。
结 果
THUNDER Imager 3D Cell Culture可以快速获取肺组织的三维图像，然后通过Instant Computational Clearing（ICC）技术去除宽场图像中会降低对比度的模糊信号（参见图1）[3，4]。ICC可以呈现肺组织图像中的精细结构和细胞水平分辨率，以研究影响肺血管疾病的发育、维持和修复活动[1，2]。
整个组织图像采集时间约1min（参见图1）。
图1：小鼠肺组织标本的扩展景深（EDoF）投影：A) 原始宽场图像，B) Instant Computational Clearing（ICC）后的高清图像。
图片来源：美国加利福尼亚州Ross Metzger博士。
结
论
使用THUNDER Imager显微镜的Instant Computational Clearing（ICC）技术[3，4]可以对小鼠肺血管疾病相关的细胞机制进行有效研究。因为与传统的宽场成像相比，该技术显著提高了图像对比度。
References：（上下滑动查看更多）
1.L.C. Steffes, A.A. Froistad, A. Andruska, M. Boehm, M. McGlynn, F. Zhang, W. Zhang, D. Hou, X. Tian, L. Miquerol, K. Nadeau, R.J. Metzger, E. Spiekerkoetter, M.E. Kumar, A Notch3-Marked Subpopulation of Vascular Smooth Muscle Cells Is the Cell of Origin for Occlusive Pulmonary Vascular Lesions, Circulation (2020) vol. 142, no. 16, pp. 1545–1561, DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.120.045750.
2.M. Boehm, X. Tian, Y. Mao, K. Ichimura, M.J Dufva, K. Ali, S. Dannewitz Prosseda, Y. Shi, K. Kuramoto, S. Reddy, V.O. Kheyfets, R.J. Metzger, E. Spiekerkoetter, Delineating the molecular and histological events that govern right ventricular recovery using a novel mouse model of pulmonary artery de-banding, Cardiovascular Research (2019) vol. 116, iss. 10, pp. 1700–1709, DOI: 10.1093/cvr/cvz310.
3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
4.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.
